As interações entre as células vizinhas originaram-se em locais distais e em diferentes épocas: células de Cajal-Retzius (células CR) e neurônios de projeção cortical migratórios precoces (estratégia A)

A interação das células de CR e dos neurônios de projeção cortical precoce foi descrita anteriormente como necessária para regular a translocação somal via moléculas de adesão de néctina e cadherina usando uma estratégia de eletroporação dupla8. As células-CR originam-se do neuroepithelium nas bordas do pálio e migram tangencialmente para povoar a parte mais superficial do córtex, a zona marginal17,,18,,19, enquanto os neurônios de projeção cortical são gerados na zona proliferativa do córtex cerebral e migram radialmente para a nascente placa cortical20. Há uma diferença temporal na geração de ambos os tipos de células. As células-CR são geradas em estágios embrionários muito precoces a partir de E10.521,22 e os neurônios de projeção cortical que migram por translocação somal nascem de E12.5-E13.523. Utilizando o dobro na eletroporação uteral, a lacuna temporal entre as cirurgias permite que as células de CR, direcionadas ao E11,5 em um de seus locais de origem (a baça cortical), atinjam a zona marginal do neocórtex lateral, incluindo a área somatosensorial a tempo de estabelecer contatos com neurônios de projeção cortical rotulados em E13,5 (Figura 1A,B). Os principais processos de neurônios de projeção expressando GFP aprimorado (EGFP) profusamente arborizam na zona marginal do córtex e se misturam com os processos de células CR que expressam mCherry (Figura 1C). Experimentos funcionais mostraram que a perturbação de moléculas de adesão celular expressa por neurônios de projeção ou células CR afeta a arborização de seus processos como consequência de contatos alterados entre ambos os tipos de células8.

Interações de longo alcance entre células distais geradas em diferentes momentos: inervação de neurônios de projeção calosal de camada superior para o lado contralateral do neocórtex (estratégia B)

Os neurônios de projeção cortical calosal estão presentes em todo o córtex cerebral, sendo mais abundantes nas camadas superiores24. Esses neurônios projetam seus axônios através do corpo caloso e entram em contato com suas células-alvo, neurônios de projeção localizados nas diferentes camadas do córtex contralateral 25,,26,,27. Os neurônios de projeção da camada superior são evolutivamente mais novos que os neurônios de camada inferior e foram muito expandidos em primatas28. Essas células são críticas para o pensamento complexo e tarefas associativas mais elevadas, e disfunções em grupos de genes especificamente expressos por essa população de células foram recentemente relacionadas com o autismo29.

Para estudar especificamente as interações da subpopulação de neurônios de projeção calisais localizados nas camadas superiores com suas células-alvo distribuídas por todo o hemisfério contralateral, desenvolvemos um duplo no protocolo de eletroporação utero. Para rotular as células-alvo dos neurônios de projeção calosal de camada superior realizamos na eletroporação utericana em E13.5 utilizando um plasmídeo expresso BFP(Figura 2AC). Esta idade foi estrategicamente escolhida porque permite não apenas atingir uma ampla população de neurônios de projeção cortical, incluindo muitos neurônios de camada V, mas também um número considerável de neurônios localizados em camadas superiores(Figura 2C),basicamente cobrindo todas as áreas alvo de neurônios de projeção calisais do hemisfério contralateral. Uma segunda eletroporação no lado contralateral em E15.5 teve como alvo a subpopulação do neurônio de projeção calosal da camada superior (expressando nEGFP e mtdTomato)(Figura 2A,B,D), mas não os neurônios de projeção de camada inferior nascidos em idades anteriores. A necessidade de eletroporação dupla heterocrônica foi, portanto, justificada devido aos diferentes tempos na geração das células de interesse projetadas e das células inervadas por elas. Esses neurônios alvos de camada superior enviam seus axônios para o hemisfério contralateral com um padrão de arborização característico(Figura 2C). Diferenças neste padrão típico de arborização axonal poderiam ser avaliadas após o ganho ou perda de experimentos de função em células-alvo usando este protocolo de eletroporação dupla. A análise de alta ampliação mostra em detalhes os axônios calosais que inervam neurônios de projeção direcionados no hemisfério contralateral(Figura 2E).

Figure 2
Figura 1: Estratégia A. Dupla na estratégia de eletroporação uteral para estudar interações próximas entre células com diferentes origens espaciais e temporais. (A) Esquemas do protocolo utilizado para atingir células cr expressando mCherry e neurônios de projeção cortical expressando EGFP. (B) Imagem representativa de uma seção coronal de um cérebro após eletroporação dupla na córmã cortical e no córtex lateral. As células alvo da baça cortical (vermelha) migram tangencialmente, povoando a zona marginal do neocórtex. Células rotuladas na zona ventricular do córtex geram neurônios de projeção cortical (verde) que migram radialmente para entrar na placa cortical nascente. Barra de escala = 200 μm. (C) Ampliação da área encaixotada no painel B exibindo o córtex lateral e os dois tipos de células rotuladas após o protocolo de eletroporação dupla. As linhas tracejadas enquadram a zona marginal e a placa cortical. Barra de escala = 100 μm. Alta ampliação à direita mostra um detalhe da zona marginal contendo os processos de liderança arborizados dos neurônios de projeção misturados com corpos e processos de células CR. Barra de escala = 10 μm. Ctx = córtex; Hem = baça cortical; MZ = zona marginal; CP = placa cortical; IZ = zona intermediária. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Estratégia B. Estratégia de eletroporação dupla para estudar interações de longo alcance entre células com diferentes origens espaciais e temporais. (A) Esquema exibindo a estratégia para atingir diferentes populações de neurônios de projeção cortical no neocórtex lateral, incluindo a área somatossensorial em diferentes hemisférios, em dobro na eletroporação utertica. Neurônios de projeção no córtex somatosensorial do hemisfério direito direcionados a E13,5 expressaram BFP. Neurônios de projeção direcionados no lado contralateral direcionados ao EGFP (nEGFP) e tdTomato (mtdTomato) expressos em EGFP (nEGFP) e tdTomato (mtdTomato). (B) Imagem representativa de uma seção coronal de um cérebro que foi submetida a cirurgia de eletroporação dupla com os plasmídeos mencionados no painel A. Observe as diferentes distribuições das células rotuladas por BFP ou nEGFP e a rotulagem intensa dos axônios dos neurônios de projeção calosal de camada superior (mtdTomato) rotulados em E15.5. Barra de escala = 500 μm. (C) Imagem do córtex somatosensorial localizado no hemisfério direito em um cérebro eletroporado duplo. Note a ampla distribuição dos neurônios de projeção (azul) através das camadas e a arborização profusa dos axônios calisais (vermelho) provenientes de neurônios de projeção direcionados no hemisfério contralateral. Barra de escala = 100 μm. (D) Imagem do córtex somatosensorial no hemisfério esquerdo de um cérebro eletroporado duplo. Observe a localização discreta dos neurônios de projeção direcionados na parte superior da placa cortical, como mostra a expressão de nEGFP (verde), bem como a rotulagem vermelha profusa em torno de corpos celulares e todas as projeções neuronais (vermelho). Barra de escala = 100 μm. (E) Imagens de alta ampliação do córtex somatosensorial no hemisfério direito mostrando detalhes da arborização dos axônios calisais em torno de neurônios de projeção direcionados. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estratégia Ordem de eletroporação Células-alvo Região-alvo Ventrículo injetado Localização dos eletrodos Tensão e pulsos Plasmídeos usados Idade da análise
Um Primeiro CÉLULA DE CR em E11.5 Cortical Hem Deixou Positivo no hemisfério esquerdo (direcionado para a parede medial) 25 V, 40 ms, 4p CAG-mCherry E17,5
Segundo Neurônios de projeção cortical em E13.5 Córtex Somatosensorial Deixou Positivo no hemisfério esquerdo 35 V, 60 ms, 5p CAG-EGFP
(direcionado para o córtex)
B Primeiro Neurônios de projeção cortical em E13.5 Córtex Somatosensorial Certo Positivo no hemisfério direito 35 V, 60 ms, 5p CAG-BFP P15
(direcionado para o córtex)
Segundo Neurônios de projeção cortical em E15.5 Córtex Somatosensorial Deixou Positivo no hemisfério esquerdo 50 V, 80 ms, 5p CAG-nEGFP-2A-mTdTomato
(direcionado para o córtex)

Tabela 1: Resumo das condições de eletroporação utilizadas nos diferentes experimentos.

Sobrevivência de embriões após duplo na eletroporação uteria na Estratégia A
Número de ninhadas Número inicial de embriões Número de embriões sobreviventes do primeiro EP Número de embriões sobreviventes do segundo EP % de sobrevivência após o primeiro EP % de sobrevivência após o segundo EP* % da taxa de sobrevivência global
9 Número total (Avg. lixo ± SD) Número total (Avg. lixo ± SD) Número total (Avg. lixo ± SD) 75% 83.33% 62.50%
64 7,11 ± 2,08 48 5,33 ± 1,22 40 4,44 ± 1,01
Número de embriões abortados após o primeiro EP Número de embriões abortados após o segundo EP Número total de embriões abortados % do aborto após o primeiro EP % do aborto após o segundo EP* % da taxa global de aborto
Número total (Avg. lixo ± SD) Número total (Avg. lixo ± SD) Número total (Avg. lixo ± SD) 25% 16.66% 37.50%
16 1,8 ± 1,09 8 0,88 ± 0,78 24 2,67 ± 1,32
*Sobrevivência e aborto calculados considerando os embriões que sobreviveram à primeira eletroporação

Tabela 2: Sobrevivência de embriões seguindo o dobro na eletroporação uteródica na Estratégia A.

Sobrevivência de embriões e filhotes seguindo a Estratégia B (EP duplo E13.5 e E15.5)
Número de ninhadas Número inicial de embriões Número de embriões sobreviventes do primeiro EP Número de filhotes nascidos após o DUPLO EP Número de embriões sobreviventes em P15 % de sobrevivência após o primeiro EP % de sobrevivência após segundo EP % de sobrevivência em P15
8 Número total (Avg. lixo ± SD) Número total (Avg. lixo ± SD) Número total (Avg. lixo ± SD) Número total (Avg. lixo ± SD) 88.46% 82.69% 55.77%
52 6,5 ± 2 46 5,75 ± 2,05 43 5,38 ± 1,77 29 3,63 ± 1,6
Sobrevivência de embriões e filhotes após um único EP no E13.5
Número de ninhadas Número inicial de embriões Número de filhotes nascidos após o PE Número de embriões sobreviventes em P15 % de sobrevivência após o PE % de sobrevivência em P15
11 Número total (Avg. lixo ± SD) Número total (Avg. lixo ± SD) Número total (Avg. lixo ± SD) 89.74% 57.69%
78 7,1 ± 1,64 70 6,36 ± 1,7 45 4,09 ± 2,07

Tabela 3: Sobrevivência de filhotes seguindo o dobro na eletroporação uteródica na Estratégia B em comparação com a eletroporação simples.

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