コンピテントセル作成 Electroporation

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 コンピテントセル作成・Electroporation 

  1. 適用可能な宿主

    Escherichia coli JM109 XL-1 Blue DH5α
    Agrobacterium tumefaciens LBA4404 GV???? EHA101

  2. 培地・試薬
    LB

      Bacto-Peptone 10g
      Bacto-Yeast extract 5g
      NaCl 10g

      1l (pH 7.2)

    YEP

      Bacto-Peptone 10g
      Bacto-Yeast extract 10g
      NaCl 5g

      1l (pH 7.5)

    10% Glycerol、Autoclaved MQ

  3. 実験操作
    1. 大腸菌のグリセロールストックをLBプレート上に播く
    2. 37℃で一晩培養しシングルコロニーを得る
    3. 10mlのLBにシングルコロニーを植え、一晩振盪培養する。
    4. 2リットルの三角フラスコに作成したLB培地(1L)に、10mlの培養液を加える。
    5. 37℃(またはそれ以下)で一晩振盪培養する
    6. 培養液の濃度を測定する(OD600=0.5〜1.0がベスト)
    7. 培養液を500mlの遠心管に分注し、4℃で15分間、5000rpmで遠心する。
    8. 上清を捨て、沈殿をそれぞれ500mlの氷冷した滅菌MQ水に懸濁する。
    9. 4℃で15分間、5000rpmで遠心し、上清を捨てる。
    10. 沈殿をそれぞれ100mlの氷冷した滅菌MQ水に懸濁する。
    11. 4℃で15分間、5000rpmで遠心し、上清を捨てる。
    12. 沈殿をそれぞれ20mlの氷冷した10%のグリセロールに懸濁する。
    13. 4℃で15分間、5000rpmで遠心し、上清を捨てる。
    14. 沈殿をそれぞれ1〜1.5mlの氷冷した10%のグリセロールに懸濁する。
    15. 50μlずつエッペンドルフチューブに分注する。
    16. 液体窒素内にチューブを投入して凍らせる。
    17. -80℃で保存する。
    18. エッペンドルフチューブを氷上に立てて、コンピテントセルを溶かす。
    19. 5μlまでのDNA溶液を、加えて懸濁する(少な目が良い)。
    20. 懸濁液をキュベットに移す。
    21. キュベット内の泡を抜く。
    22. ジーンパルサーを以下の条件に合わせる
      • 2.5KV (または1.8KV)
      • 25μF
      • 200 Ω
    23. FIRE!
    24. キュベット内に、LB(またはSOB、SOC)を1ml加えて懸濁
    25. 懸濁液を元のチューブに戻して、37℃で30〜60分振盪する。
    26. 適当量(コンピテンシーに依存)を抗生物質入りのLB培地に播く。
    27. 37℃で一晩培養する。



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